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简介：面向分子生物学实验入门者与需要在大肠杆菌中表达目的蛋白的研究人员，这份文档围绕原核表达的关键流程与载体选择展开，重点梳理Novagen pET系列载体的T7表达系统、DE3宿主菌与IPTG诱导的调控关系，并延伸到可溶性表达标签、LIC克隆、pETcoco低拷贝控制及pLysS/pLysE稳质粒策略。包内共1个doc文件，约73KB，篇幅集中，适合作为实验设计前的速查资料。已有87人学习，内容还涉及宿主菌株改造、包涵体形成、蛋白折叠与翻译后修饰等常见问题的应对思路，可帮助读者在载体、菌株和培养条件之间建立选择依据，减少试错。整体偏向技术要点归纳与方案对照，适合具备基础分子克隆知识、希望快速梳理原核表达体系的人参考。

1. 从“测序全对却没有条带”说起：原核表达到底卡在哪一环

质粒测序全对、双酶切图谱干净、转化也长出了单克隆，诱导四个小时跑 SDS-PAGE，胶上却是一片空白——这是我见过最多的原核表达翻车现场，也是最容易让人怀疑人生的一种。原核表达从来不是“把基因塞进大肠杆菌”这么一步，它是一套由载体、宿主菌、诱导条件和检测手段咬合起来的系统，任何一环错位，最后都表现为“没条带”这三个字。T7 系统之所以成为主流，是因为它把转录做成了近乎独占的生意：T7 RNA 聚合酶只认 T7 启动子，一旦诱导，宿主自身转录根本竞争不过它。下面按原理、载体、菌株、参数、排查、验证的顺序拆一遍，第一次搭体系的人能照着走，已经在某个蛋白上卡了几轮的人可以回头对参数。

2. T7 系统的三层开关：DE3 溶源、T7lac 与 pLysS 怎么叠

2.1 T7 RNA 聚合酶为什么能把宿主转录挤下去

T7 噬菌体自带一套专一性极强的转录体系。它编码的 T7 RNA 聚合酶只识别 T7 启动子，而大肠杆菌自身的 RNA 聚合酶也不认 T7 启动子，两套系统互不干扰，这是整个设计的地基。活性上的差距更关键：T7 RNA 聚合酶合成 mRNA 的速度大约是大肠杆菌 RNA 聚合酶的 5 倍，还能转录一些宿主聚合酶转录不动的序列。当细胞里同时存在聚合酶和 T7 启动子时，宿主自身基因的转录被压得几乎没有声音，细胞资源几乎全部倒向目的基因，诱导几个小时目标蛋白占到总蛋白一半以上并不罕见。

这里有个反直觉的点要先记住：转录越猛，对可溶表达越不友好。转录和翻译速度一快，新生肽链来不及折叠就被堆在一起，直接变成包涵体。后面排查章节里“全在沉淀里”那一类问题，根子在这里，不在操作。

还有一个事实决定了所有调控技巧的走向：大肠杆菌染色体上本来没有 T7 RNA 聚合酶基因。所以 T7 系统真正被调控的对象从来不是启动子，而是聚合酶有多少、活性有多高。DE3、T7lac、pLysS、葡萄糖，管的全是这一件事。

2.2 DE3 溶源与 pLysS/pLysE：本底表达的两道闸

DE3 是 λ 噬菌体的衍生株，一段含有 lacI、lacUV5 启动子和 T7 RNA 聚合酶基因的 DNA 片段被插进它的 int 基因里。拿 DE3 的溶源菌当宿主，调控逻辑就是化学信号诱导型，和 Lac 系统一个套路：不加 IPTG，lacUV5 转录弱，聚合酶少；加了 IPTG，阻遏蛋白构象改变离开操纵基因，聚合酶大量合成，再去激活载体上的 T7 启动子。BL21(DE3)、HMS174(DE3) 都属于这一类，构建好的表达载体可以直接转进去。

问题在于痕量本底。lacUV5 再严谨也有渗漏，目的蛋白一旦对细胞有毒，一点点本底就足以让质粒在传代和筛选过程中被丢干净。常见的三道闸，代价从小到大排：

pLysE 是个典型的两头堵：抑制更彻底，但宿主长得慢、诱导后蛋白迟迟不出来，滞后时间拉长，最终产量经常不如 pLysS。我一般的做法是先上 pLysS，只有确认质粒在构建阶段就丢，才考虑 pLysE。这类质粒的复制子与常见表达质粒相容，不影响后续转化，但双抗筛选时要留意抗生素搭配，别把两个抗性搞混。

除了 DE3 溶源，还有两条不常用的路：一是用不带 T7 RNA 聚合酶的宿主先克隆，再用携带聚合酶基因的噬菌体侵染；二是共转化一个提供聚合酶的质粒，甚至用溶氧响应型启动子控制聚合酶合成。前者适合极毒蛋白，后者在发酵罐上有点意思，但实验室日常用不上。

2.3 诱导参数：IPTG 浓度、温度、时间怎么定

参数没有标准答案，但有稳定的调节方向。下面这张表是我自己贴在实验记录本第一页的版本：

具体操作我固定走这么一串：

1. 从新鲜划线的平板上挑单克隆，接 3–5 mL 含相应抗生素的 LB，37 ℃、220 rpm 过夜 12–16 h。不要用 4 ℃ 放了一两周的菌液，抗生素可能已经失效，质粒也可能丢了一部分。
2. 按 1:100 转接到新鲜培养基，37 ℃ 培养到 OD600 到 0.6–0.8。
3. 诱导前取 1 mL 样，这就是未诱导对照，离心弃上清，菌体可以先扔 -20 ℃。
4. 加 IPTG 到终浓度，同时留一管只加等体积无菌水的作空白。
5. 按 1 h、2 h、4 h（或过夜）分别取样，每次记录 OD600。
6. 离心 12000 g、1 min，弃上清，用 1×上样缓冲液重悬，沸水浴 5–10 min。
7. 上样跑 SDS-PAGE，上样量按 OD 折算成等量菌体。

第 5 步和第 7 步是最容易被省掉、也最不能省的。不按等 OD 上样，条带深浅就没有比较意义；不留未诱导对照，你根本说不清那条带是诱导出来的还是宿主本来就有的。第 3 步那个管子，是后面所有判断的基准。

温度的选择有个实用顺序：先用 37 ℃、4 h 跑一块胶，确认有没有表达、表达量大不大。确认有表达但全在沉淀里，再降到 25 ℃ 或 16 ℃ 重做。别一上来就 16 ℃ 过夜，长得慢、表达量低，第一次做很容易误判成“不表达”。

3. 载体选型：先回答“要不要可溶”，再谈标签和拷贝数

3.1 起始密码子与读码框：先把 N 端这件事定下来

选载体的第一个岔路口是：用基因自身的起始密码子，还是用载体自带的 ATG。想用基因本身的起始密码子，可选范围会窄很多，pET-21(+)、pET-24(+)、pET-23(+) 是其中常见的三个；打算用载体的起始密码子，选择就多得多，各种带标签、带信号肽的版本都能挑。

想 N 端干净又不换载体，还有两条路：一是用 NdeI 这类位点直接从起始密码子后插入外源片段；二是先带标签表达，纯化后用蛋白酶把多余多肽切掉。

不管走哪条，读码框这件事要在引物设计阶段就锁死。载体上的 ATG 和插入位点之间往往还有一段载体序列，把这段和你的片段连起来翻译一遍，看有没有移码或提前出现的终止密码子。需要的话在引物里补 1–2 个碱基把框调正。终止密码子同理：多数载体自带，但如果你对载体的那一段不放心，直接在引物里设计上，多一层保险。

3.2 融合标签：增溶、促二硫键、还是只为了纯化

外源蛋白在大肠杆菌里不加任何修饰，很多时候就是以不溶的包涵体形式出现。融合表达大致有三条策略：接一个高度可溶的多肽一起表达，比如 GST、硫氧还蛋白 Trx、NusA；转入一个催化二硫键形成的酶，比如 Trx、DsbA、DsbC；插入一段定位到周质空间的信号序列。

选择逻辑很直接：特别小的分子（比如 10 kDa 以下）建议用大标签，GST 或 MBP，靠融合部分把整体撑起来，避免被降解；60 kDa 以上的蛋白反过来，用 His6 这种小标签，否则融合蛋白太大，表达和折叠都吃力。His-Tag 是采用最广的一个，因为纯化条件温和、树脂便宜。

有个隐性成本经常被忽略：检测抗体。曾经为了图省事选了个冷门标签，等到要做 Western 鉴定才发现单抗又贵又难买，货期还长，整个进度被卡住。His6 和 GST 的抗体便宜、现货多，实验室之间还能互相借。选载体的时候顺手把这一步想清楚，能省掉后面很多麻烦。

3.3 低拷贝与不依赖连接的克隆

复制子决定了质粒拷贝数。pSC101 类是严谨复制、低拷贝；pCoE1、pMBI（pUC）类的拷贝数能到 500 以上，是表达载体最常用的。拷贝数和表达量是非线性的正相关，但不是越多越好，超过细胞承受范围反而拖累生长，最终产量下降。如果要做两个质粒共转化，还要先确认复制子是否相容，否则其中一个会被挤掉。

低拷贝这条路上有个设计挺巧妙：引入 F 附加体上的 oriS 和 repE，配合 parABC，让质粒在细菌里维持单拷贝。好处是稳定、对细胞毒性小、适合毒蛋白；需要大量表达时加阿拉伯糖诱导 trfA 基因，拷贝数可以升到 25–50，同时它兼容 DE3 调控，IPTG 一加，表达量还能再上一层。做毒性蛋白或者需要长期保存的构建，这类载体值得考虑。

克隆方式上，除了传统的酶切连接，还有不依赖连接的 LIC：载体先线性化，末端留 12–15 个突出的碱基，与目的片段互补；设计 PCR 引物时把这十几个碱基加在 5' 端；PCR 产物用 3'→5' 外切酶消化出单链，退火后定向插入，全程不用连接酶。省掉酶切、去磷酸化、连接、转化这一串，阳性率还高。缺点是引物长一点、成本高一点，做大批量构建的时候很划算。

3.4 双基因共表达：一个质粒装两个片段的思路

做复合物或者一条通路上的两个酶，常规做法是分别构建、共转化，但两个质粒的复制子和抗性都得配。双表达载体把这件事简化了：两个不同的多克隆位点，各自带独立的 T7 启动子、乳糖操纵子和核糖体结合位点，一个质粒装两个基因。不同版本复制子和抗性不同，共转化最多可以同时表达八个外源蛋白。

要注意两个位点的核糖体结合位点强度不一样，同样两个基因换个位置，表达量可能差好几倍。第一次做出来比例不对，先试试对调，别急着改序列。

启动子强度也值得在这章末尾对一遍：

看出规律没有：T7 是最强的那一档，适合难表达、产量优先的蛋白；但如果目标是可溶、有活性，反而要往弱里选，或者用强启动子配低诱导强度、低温，把速度压下来。

4. 菌株匹配：蛋白酶缺陷、lacY1 与稀有密码子补给怎么选

4.1 蛋白酶缺陷与 recA 背景

B 菌株的衍生株基本都是 lon 和 ompT 双缺陷，包括 B834、BL21、BLR、Origami B、Rosetta、Tuner。lon 编码胞内 ATP 依赖蛋白酶，ompT 编码外膜蛋白酶，两个都缺，纯化过程中目标蛋白被降解的概率明显下降。BL21(DE3) 是应用最广的表达宿主，绝大多数常规构建直接用它起步。

BLR(DE3) 在这个基础上多了 recA 缺陷。RecA 是大肠杆菌中介导同源重组的关键蛋白，它一缺，质粒上的重复序列不容易重排，质粒稳定性更好。构建里带长重复序列、或者要长期保存不重排的，换这个宿主更稳妥。

4.2 Tuner 的 lacY1：让每个细胞吃到一样多的 IPTG

Tuner 及其衍生株（Origami B、Rosetta）是 BL21 的 lacY1 缺失突变。lacY 编码乳糖渗透酶，缺失之后 IPTG 进入每个细胞的量趋于一致，不再出现“一部分细胞吃得饱、一部分根本进不去”的情况。带来的直接好处是表达在细胞群体里更均一，而且表达强度可以随 IPTG 浓度线性调节——想微量表达就加低浓度，想拉满就加高浓度。

这一点在做可溶蛋白时特别有用。低浓度 IPTG 把表达速率压下来，折叠有时间跟上，可溶比例往往比高浓度诱导高出一截。常规宿主做不到这种细调，因为渗透酶的存在让摄入量饱和得很快。

4.3 gor/trxB：给胞质创造偏氧化的环境

二硫键在大肠杆菌胞质里不好形成，因为胞质本身是还原环境。gor 编码谷胱甘肽还原酶，trxB 编码硫氧还蛋白还原酶，这两个基因缺陷之后，胞质变得偏氧化，二硫键形成效率提高，蛋白以可溶、有活性形式出现的概率上升。相关菌株包括 AD494、BL21trxB、Origami、Origami B、Rosetta-gami。

判断要不要换这类宿主很简单：目标蛋白序列里有没有必须成对的半胱氨酸，表达出来有没有活性。跑胶能看到带但酶活为零，先怀疑二硫键没形成，换宿主比优化诱导条件来得快。

4.4 稀有密码子与 B834

不同物种密码子偏爱性差异很大。外源基因里如果集中出现大肠杆菌的稀有密码子 AUA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA，尤其连续分布的时候，表达量会极低，甚至翻译提前终止。跑胶上看到的就是一条比预期小很多的带，或者干脆什么都没有。

Rosetta 系列专门为此设计，带一个氯霉素抗性的质粒，提供上述几个稀有密码子的 tRNA。它本身来自 BL21 lacY1，所以具备 lacY1 的全部特性。操作上要注意：这个辅助质粒是要靠氯霉素维持的，培养基里别忘了加，否则养几代就丢了，然后你会以为换宿主没用。

B834 是 BL21 的甲硫氨酸营养缺陷型，用于硒代甲硫氨酸标记和 35S-Met 标记，做晶体相位或者高特异活性标记时用得上。日常表达不用考虑它。

菌株选择的三问顺序：要不要二硫键，有没有稀有密码子密集区，蛋白毒不毒。三个问题定完，剩下的只是要不要用 Tuner 做表达强度微调。

5. 五个高频翻车现场：从无条带到全在沉淀里的排查路径

5.1 诱导后一条目标带都没有

现象：对照齐全，诱导前后胶上没有任何新增条带，连微弱差异都看不出。

原因通常按概率排：最常见的是用了不带 DE3 的菌株，载体转进去了、抗性也筛出来了，但没有 T7 RNA 聚合酶，T7 启动子根本没人理；其次是测序只看了插入片段两端，中间有移码或提前终止没发现；第三是载体在多次周转中在启动子下游带进了转录终止信号，尤其是反复插入不同片段、或者粘端相同的不同酶切片断之间连接之后；第四是稀有密码子连续分布导致翻译提前终止或效率极低；第五是培养基里残留葡萄糖，把本底和诱导一起压住了。

解决顺序：先核对宿主菌基因型，这一步五分钟就能排除掉一半可能；再把整个插入片段连同两端的启动子区、终止子区一起重测序，别只测插入段；然后去掉培养基里的葡萄糖重新诱导；还不行就换 Rosetta 试一轮；最后才考虑换载体或换系统。

提示：换宿主之前先看载体的调控方式。不同调控机制对应不同宿主，随便换一个可能什么都不会发生。

5.2 条带比预期小一截

现象：预期位置空的，下方多出一条明显偏小的带。

原因有三类。一是蛋白酶降解，lon/ompT 虽然已经缺陷，但高表达时蛋白酶系统仍然可能跟不上，尤其目标蛋白本身对蛋白酶敏感。二是稀有密码子造成的翻译提前终止，产物就是截短的。三是电泳本身造成的假象：带电量高的蛋白结合 SDS 少，泳动受阻；富含脯氨酸的蛋白在胶里跑得特别慢；等电点在 5–9 之间、氨基酸组成又没有明显偏好的蛋白，迁移率与预期差得比较远时，基本可以排除电泳因素。

排查办法是用 N 端或 C 端标签做一次 Western。如果只有全长的带被抗体检出，那就是降解或截短；如果大小不符的带也能被 C 端抗体识别，说明那段序列确实翻译出来了，问题在迁移率而不是长度。确认是降解，降低诱导温度、缩短诱导时间、换蛋白酶缺陷更彻底的宿主；确认是截短，考虑稀有密码子补给。

5.3 目标蛋白全在沉淀里

现象：超声破碎后离心，上清里几乎没有目标带，沉淀重悬后条带浓得发亮。

原因基本就一句话：表达速率超过了折叠速率，新生肽链来不及正确折叠，聚成致密不溶的包涵体颗粒。强启动子加高浓度 IPTG 加 37 ℃，是最容易出这个结果的组合。

处理方向和原因一一对应：温度降到 25 ℃ 或 16 ℃，IPTG 降到 0.05–0.1 mM，换带增溶标签的载体（GST、Trx、MBP），共表达分子伴侣，或者加周质空间信号肽把蛋白导到膜间隙去折叠。

但先别急着把包涵体当成失败。包涵体致密、抗蛋白酶降解、纯度高，如果目标是做抗体制备，用 PBS 悬浮、佐剂乳化后免疫动物，反而是一条省事的路。真正麻烦的是需要活性蛋白——那就得走上尿素溶解、变性纯化、再复性的流程，复性是下游最折磨人的一步，能避开就优先避开。

5.4 抗生素失效与质粒丢失

现象：不加抗生素的对照管也长得很好；或者前几个小时表达正常，诱导后期目标带越来越淡。

原因是多层的。倒平板时培养基温度太高就加抗生素，氨苄最容易中招，温度一高就降解，平板看着能用，其实筛选压力早就没了。菌液在 4 ℃ 放太久，抗生素失效、质粒丢失同时发生。高拷贝质粒加上高表达带来的代谢负担，也会让不带质粒或者质粒突变的细胞在群体中占优。

对策很土但有效：培养基灭菌后降到不烫手的温度再加抗生素，氨苄最好现配现加；每次实验都从新鲜划线的平板挑单克隆，别拿冰箱里的过夜菌直接转接；毒蛋白用低拷贝载体或者带 pLysS 的宿主。还有一条容易被忽略的卫生习惯——已经长出抗性菌的平板和废液，处理掉之前该灭活的灭活，别随手倒。

5.5 对照不全导致的误判

现象：胶上确实多了一条带，兴冲冲往下做，Western 一做发现是宿主蛋白；或者以为没表达，其实是诱导条件根本没生效。

这类问题不出在实验本身，出在判读依据不足。缺了未诱导对照，你分不清新增条带是诱导出来的还是本来就有的；缺了空载体诱导对照，你分不清那条带是不是载体自身序列表达的；缺了诱导时间梯度，你看不出表达是刚起来还是已经开始降解。省掉这几孔胶，后面所有判断都是猜的。

6. 把一块胶跑成证据：对照设置、染色灵敏度与可溶性判定

胶上的每一孔都该有明确用途，凑数上样等于白跑。我固定这么排：Marker 一孔定大小；有标准品就加一孔阳性对照，验证 Western 体系和显色是否正常；空载体诱导一孔看载体自身背景；重组载体不诱导一孔排除诱导剂对宿主的干扰；剩下的按 1 h、2 h、4 h 排诱导梯度。十二孔胶刚好排满，少了任何一孔，结论都会打折扣。

染色方式决定灵敏度，也决定这块胶还能不能接着做 Western。考马斯亮蓝灵敏度在 100 ng 左右，够看主要条带，但染过之后基本没法再做免疫检测；银染灵敏度能到 0.1–1 ng，适合表达量很低的情况，同样不兼容后续；荧光染料灵敏度高，而且染色后还能继续转膜做 Western，成本高一些，赶时间或者样品珍贵的时候值。

可溶性判定就在第 7、8 两孔：超声破碎、离心，上清和沉淀分别处理后上样，目标带在哪一侧一目了然。这一步比反复猜“是不是包涵体”可靠得多。

我自己的血泪经验是：毕业前赶一批构建，为了省时间把未诱导对照和空载体对照全砍了，胶上看到一条粗带就往下做纯化，纯到最后发现是宿主的外膜蛋白，两周白干。从那以后我每次上机前都强制把这两孔排进胶里，哪怕只跑一块十二孔胶、哪怕样品只剩一点点。希望帮到你。

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