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想一想，柱形图、WB、PCR这些老掉牙的，在我们的申请书中占比大吗？预实验有没有“帅到天际”的图片？像这张mHIC图，不仅颜值爆表，还能多层次、多维度的呈现你的科研成果，让专家评委们眼前一亮。

mIHC (multiplex immunohistochemistry)中文名称有多个，比如多重免疫组化、多重免疫荧光、多色免疫组化、酪氨酸信号放大（TSA）技术。有趣的是这一实验的结果均为荧光显色，我们却常常称之为免疫组化。mIHC可以在同一张片子上对同一个样本的不同靶点进行多种检测。上图右侧为DAPI复染+八重免疫组化结果，结合生物信息学数据，解析组织复杂微环境中的细胞表型、功能状态和空间拓扑关系。

这么“高大上”的实验一定难做吧？那我们就从原理开始，手把手的操练一下吧。

一、为什么可以重复染色？

mIHC属于免疫组化与荧光标记结合实验，关键在于TSA稳定性比抗原-抗体间的结合力强。TSA荧光染料由酪胺分子和荧光染料偶联而成。二抗标记的HRP能够催化过氧化氢反应，使非活性的酪胺分子成为具有活性的中间态分子并形成共价键结合位点，与邻近蛋白（如靶蛋白、一抗、二抗及HRP）的富电子区域（如色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基）发生共价偶联。荧光染料也随之沉积，使信号放大。

由于抗原-酪胺间的共价键稳定性远高于抗原-抗体间的非共价键结合力，通过微波或高温修复可以洗脱掉已结合的抗体，只保留与抗原偶联的TSA荧光信号。随后换不同靶蛋白的抗体、不同激发波长和发射波长的TSA染料进行第二轮孵育染色。如此重复就能实现多重染色。

mIHC操作步骤示意图

二、mIHC详细操作步骤

2.1预实验准备

毕竟mIHC实验操作繁琐、周期长，一旦开始就要“一镜到底”，我们建议在正式实验之前完成一些验证工作，比如：

对所有样本进行HE染色，评估取材、脱水、包埋、切片等环节的操作是否正确。还需要对一抗设置高、中、低的浓度梯度，用阳性组织进行单个靶点的免疫组化，确定其有效浓度。同样，我们也需要进行TSA染料单靶点测试，确定各靶点的一抗浓度、TSA染料搭配方案，明确染色顺序。染色的原则是先弱后强，前1-2轮染低丰度靶点，中间轮进行免疫细胞标记，后面进行高表达蛋白。

在正式实验之前，选择1-2个小样本进行小量的mIHC预实验。在确定后进行正式实验过程中，不用随意更改已验证好的实验条件，如一抗稀释度及孵育条件、抗原修复液类型及修复条件、二抗种类及孵育条件等。

2.2样本制备与抗原修复

1）石蜡切片

· 取材：注意控制组织块的体积，确保固定液均匀渗透。用PBS或生理盐水冲洗，去除血液和组织液。

· 固定：10%福尔马林（或甲醇、乙醇）室温固定18-24小时。

· 脱水：梯度酒精，75%→85%→95%→无水乙醇（Ⅰ）→无水乙醇（Ⅱ），各30-60 min。

· 透明：二甲苯浸泡2次，每次30min。注意过的透明会导致组织变硬易碎。

· 浸蜡包埋：将样本浸入熔融石蜡中，置于恒温箱，使石蜡充分均匀的渗入组织内部。完成浸蜡后将样本放入模具，倒入溶化的石蜡，待石蜡自然冷却凝固。

· 切片：用切片机将包埋后的组织样本切成4-6 μm厚的薄片。

· 烤片：用细毛刷温柔的将切片从切片刀上取下，置于40℃温水中使其展平。用载玻片捞出后，在烤片机上60℃烘烤2小时以上，增强切片吸附力。

· 脱蜡：依次使用二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ进行梯度脱蜡，每缸浸泡5分钟，彻底清除石蜡。

· 复水：采用梯度乙醇（100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇）依次脱水，每级作用5分钟；最后经纯化水浸5分钟完成水化过程。注意需要避免干片，干片会导致非特异性抗体结合出现高背景。

2.3多重免疫组化染色

1）抗原修复

推荐热诱导法，常用修复缓冲液：柠檬酸盐缓冲液 (pH 6.0)、EDTA 缓冲液 (pH 8.0) 或 Tris-EDTA 缓冲液 (pH 9.0)。高压热修复是在染色盒中加入抗原修复液，放入切片，置于高压锅内加热至饱压后继续加热5min，关闭电源，自然冷却至室温。还可采用微波热修复法。

2）灭活

去除玻片上残存洗液，用免疫组化笔圈出玻片上的样本区域，滴加3%双氧水浸没样本区域，灭活10min。

3）封闭

用1× TBST浸洗玻片3次，每次2min，滴加封闭液（5% BSA 或者血清），覆盖样本区域，室温孵育10-30 min。

4）一抗孵育

用1× TBST浸洗玻片3次，每次5min。

按照说明书将一抗稀释到合适浓度。使用移液器将稀释后的一抗均匀覆盖样本区域，置于湿度平衡的孵育盒中，室温孵育30-60min。用1× TBST浸洗玻片3次，每次5min。

5）二抗孵育

室温孵育1h，注意避光和干片。用1× TBST浸洗玻片3次，每次2min。

6）TSA信号放大

滴加1× TSA荧光染料染色工作液，浸没样本区域。室温孵育5-10min，用1× TBST浸洗玻片3次，每次2min。

7）抗体脱落

石蜡切片采用与抗原修复相同的操作，以去除抗体。

重复以上操作，进行后续的多轮染色。

每轮染色结束后可用荧光显微镜确认染色情况。注意用TBST覆盖样品，防止干片。

2.4镜检阅片

滴加DAPI工作液到样本上，室温孵育5-10 min，PBS洗涤一次，用抗荧光淬灭封片剂封片。长期保存建议用透明指甲油对盖玻片边缘进行密封。

切片于荧光显微镜、共聚焦、多通道荧光扫描仪、多光谱成像系统下观察并采集图像。

三、冰冻切片与细胞样品的mIHC操作

在样品处理和染色操作上，两者与石蜡切片存在较大差异。

3.1冰冻切片

冰冻切片流程：取材→包埋（<30s）→冷冻（1-3min）→切片（2-5min）→固定（10-15s）→染色（4-5min）→封片（<1min），可在10-15min内完成。

冰冻切片通常用OCT包埋剂进行包埋，选择快速固定（95%乙醇+5%冰醋酸（30秒）或AF液（甲醛+乙醇+冰醋酸）），不需要进行抗原修复。建议对组织进行通透处理，用0.1-0.3%的Triton X-100覆盖组织，室温孵育20min，PBST洗涤5min×3次。

3.2细胞样品

用1×PBS洗涤2-3次。用4%多聚甲醛室温固定10-15min，用1xPBST 洗涤5min×3次。用0.1-0.3%的Triton X-100室温孵育20min，再次用PBST 洗涤3次。

因为冰冻切片和细胞样品不需要抗原修复，其抗体洗脱建议滴加适量37℃预热至完全溶解的mIHC专用抗体洗脱液均匀覆盖样本，37℃放置5-20min，弃洗脱液，再次滴加适量抗体洗脱液均匀覆盖样本，37℃放置5-20 min。