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【实验技术】真菌基因敲除标准化方案，可直接复现

前言

在微生物基因编辑领域，真菌基因敲除是验证基因功能、解析调控通路、筛选研发靶点的核心实验技术。本文基于最新研究，完整拆解白念珠菌 SHO1 基因真菌基因敲除的实验设计、参数、流程与质控，为实验室提供可落地的实操指南。

白念珠菌为二倍体真菌，需双等位敲除才能完全丧失基因功能，传统方法存在表型干扰、转化效率低等问题。本文采用融合 PCR+His/Leu 营养缺陷标记的真菌基因敲除方案，稳定实现双等位敲除，适合科研与研发场景复用。

1 实验设计与材料

1. 靶基因：SHO1（高渗透压信号蛋白 1 基因）
2. 亲本菌株：白念珠菌 SN152（His-/Leu-/Arg-）
3. 筛选标记：His（pSN526）、Leu（pGAL）
4. 核心试剂：高保真酶、DTT、山梨醇、YPD/MM 培养基
5. 仪器：PCR 仪、电泳系统、电转仪、凝胶成像仪

2 核心步骤：真菌基因敲除全流程

2.1 菌株活化与缺陷验证

甘油菌接种 YPD 培养基，35℃过夜活化；转接 LB 培养基培养 4h；涂布 MM 缺陷平板，35℃培养 3–5d，确认缺陷性状合格。

2.2 融合 PCR 构建敲除盒

分别扩增 5' 同源臂（291bp）、3' 同源臂（264bp）、His/Leu 标记片段；PCR 体系 50μL：模板 2μL、引物各 2μL、水 19μL、高保真酶 25μL；程序：95℃3min→35 循环（95℃15s→退火 55–59℃15s→72℃延伸）→72℃5min。融合 PCR 拼接同源臂与标记，获得 His 敲除盒（2766bp）、Leu 敲除盒（1095bp），1% 琼脂糖电泳回收备用。

2.3 感受态制备与电转化

1. 菌体培养至 A600≈0.8，5000r/min 离心 5min；
2. 1×TE LiAc 重悬，35℃、150r/min 处理 45min；
3. 加 DTT 处理 15min，无菌水与山梨醇洗涤；
4. 100μL 感受态 + 0.1–10μg 敲除盒，0.1mm 电击杯；
5. 电击条件：1.6kV、200Ω、25μF，复苏后涂布缺陷平板。

2.4 敲除株三重鉴定

• His 上游：608bp；Leu 上游：361bp；SHO1：487bp
• 电泳条带与预期一致，测序比对无误，判定敲除成功。

3 表型检测结果

• 生物膜：结晶紫染色显示敲除株 OD595 显著降低（P<0.01）
• 黏附：缺陷株黏附能力下降（P<0.05）
• 形态：菌丝生成受抑，以酵母态为主

4 实验关键控制点

1. 感受态必须使用对数期菌体，保证活性
2. 融合 PCR 严格控制退火温度，避免错配
3. 电转化后充分复苏，提高阳性率
4. 鉴定采用多重验证，杜绝假阳性

5 总结

本方案实现稳定高效的真菌基因敲除，解决二倍体真菌敲除难点，无标记干扰、无脱靶风险，是病原真菌基因编辑的标准化技术方案。

参考文献：贾克然，秦立霞，郑洁，等。白念珠菌 SHO1 基因敲除株的构建及鉴定 [J]. 中国真菌学杂志，2026,21 (1):53-58.